血管系統(tǒng)是循環(huán)系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，應(yīng)用熒光納米探針對活體腦血管進(jìn)行可視化研究對了解常見的腦部疾病具有重要意義。雙光子熒光（2PF）顯微鏡由于其傳統(tǒng)的近紅外激發(fā)和低的光漂白傾向，通常被用于體內(nèi)深層組織成像。然而，即使借助于顱窗，由于生物基質(zhì)中激發(fā)光束的光散射，2PF成像通常也僅限于淺層深度成像。此外，由于整體顱骨永久性丟失，導(dǎo)致術(shù)后動物存活率低。自然環(huán)境的擾動和腦組織的炎癥是不可避免的破壞性干擾，導(dǎo)致成像質(zhì)量的降低。因此，用無創(chuàng)的方法觀察自然環(huán)境中的腦是研究腦疾病的理想方法。
為了解決上述問題，三光子熒光（3PF）顯微成像作為一種有效的成像方式正在迅速發(fā)展。與傳統(tǒng)的2PF成像不同，3PF成像技術(shù)利用近紅外區(qū)域（1000-1700nm）的高階非線性局域激發(fā)，顯著提高了穿透深度、時空分辨率和信背景比（SBR）。盡管有這些優(yōu)點，3PF成像的一個主要限制是缺乏具有大的三光子吸收截面和高熒光量子效率的有機(jī)染料。
最近，香港科技大學(xué)唐本忠院士、中山大學(xué)梁國棟副教授和浙江大學(xué)錢駿教授合作在《Advanced Materials》上發(fā)表了題為“Facile Synthesis of Efficient Luminogens with Features for Three‐Photon Fluorescence Imaging of the Brain through the Intact Skull”的文章，報道了他們在3PF成像有機(jī)染料方面的進(jìn)展。他們通過簡單的反應(yīng)路線合成了具有顯著聚集誘導(dǎo)發(fā)射（AIE）特性和高量子產(chǎn)率（42.6%）的固體發(fā)光材料。合成的BTF分子具有超亮的遠(yuǎn)紅/近紅外發(fā)射，可以通過簡單的納米沉淀工藝制備成AIE點。AIE點具有高亮度、大的Stokes位移、良好的生物相容性、良好的光穩(wěn)定性和大的三光子吸收截面，可以作為一種有效的熒光納米探針，通過三光子熒光顯微成像技術(shù)對完整的顱骨進(jìn)行活體腦血管成像。這是第一個使用AIE點通過完整小鼠顱骨來可視化腦卒中過程的例子，且具有高穿透深度和良好圖像對比度。這些良好的結(jié)果有望為開發(fā)用于活體腦的無創(chuàng)生物成像、具有強(qiáng)非線性光學(xué)效應(yīng)的高效發(fā)射體開辟一個新的途徑。
圖文導(dǎo)讀
1.AIE發(fā)光劑的分子設(shè)計與性能
作者設(shè)計了AIE發(fā)光劑BTF，它具有強(qiáng)電子供體三苯胺（TPA）、叔丁基（t-Bu）基團(tuán)和電子受體富馬腈（FN）。BTF具有供體-受體（D-A）結(jié)構(gòu)，使分子具有FR/NIR發(fā)射和明顯的多光子吸收。此外，BTF還含有更多可自由旋轉(zhuǎn)的苯環(huán)和t-Bu基團(tuán)，有利于通過分子內(nèi)運(yùn)動消耗溶液態(tài)的激發(fā)態(tài)能量。這些運(yùn)動被限制在聚集態(tài)，這使得激子能夠輻射衰減以促進(jìn)AIE過程。此外，扭曲的TPA部分和BTF的龐大t-Bu基團(tuán)阻礙了強(qiáng)π-π堆積相互作用的形成。這些因素使BTF具有長波長發(fā)射和高量子效率。
BTF在常見有機(jī)溶劑中具有良好的溶解性，但不溶于水。為了研究聚集和溶劑極性對BTF發(fā)射過程的影響，他們測量了不同水含量（fw）的THF/水混合物的PL光譜。BTF在純THF中發(fā)出微弱的熒光（圖1C）。當(dāng)在BTF的THF溶液中加入少量水（fw≤50%）時，由于典型的扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（TICT）效應(yīng)，BTF的發(fā)射減弱。在極性環(huán)境中，這些分子經(jīng)歷從供體到受體部分的快速分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移，分子內(nèi)D–A構(gòu)象從共面結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榕で鷺?gòu)象。隨著水含量的進(jìn)一步增加（fw≥60%），BTF分子由于疏水作用而形成納米聚集體。納米聚集體中的疏水環(huán)境緩解了TICT效應(yīng)，使AIE效應(yīng)作為主導(dǎo)因素更加明顯，導(dǎo)致BTF混合物的PL強(qiáng)度增加。當(dāng)fw = 90%時，PL強(qiáng)度達(dá)到最大值，是純THF溶液的5倍(圖1D)。因此，?BTF是AIE活性分子。純THF溶液中BTF的熒光量子效率（ΦF）為2.7%，在固態(tài)下顯著提高到42.6%。
2.生物成像應(yīng)用
聚集體態(tài)BTF具有高ΦF的FR/NIR發(fā)射，可以用于生物成像。為了使疏水性BTF在水介質(zhì)中具有良好的水分散性，采用兩親性聚合物Pluronic F-127作為生物相容性的封裝劑來制備BTF點（圖2A）。在水溶液中，Pluronic F-127和AIE分子的親脂部分形成納米點核，親水部分伸入水中形成外殼。BTF點在水溶液中的最大吸收波長為500nm，與515nm的商業(yè)激光激發(fā)非常吻合。BTF點的PL光譜在紅色區(qū)域（645nm）處達(dá)到峰值，并很好地延伸到近紅外區(qū)域（800nm）。BTF點比傳統(tǒng)有機(jī)染料（通常<25nm）具有更大的斯托克斯位移（>130nm），這有利于高對比度生物成像應(yīng)用，因為自吸收的發(fā)射猝滅傾向較小。BTF點的熒光量子產(chǎn)率（ΦF）為36.1%。
BTF點具有長期穩(wěn)定性。即使它們在磷酸鹽緩沖液（PBS）中的懸浮液在室溫下保存很長時間，它們的熒光光譜幾乎保持不變。而且BTF點的細(xì)胞毒性較低。在不同濃度（12.5、25、50和100mg mL-1）下與HeLa細(xì)胞孵育24小時后，細(xì)胞活力均保持在95%以上。BTF點具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性。將BTF點分散在不同的pH值的緩沖溶液下，未檢測到UV和PL的明顯變化。
他們繼續(xù)研究了BTF點的非線性光學(xué)特性。在1550nm的近紅外飛秒（fs）激光激發(fā)下，三個1550nm的光子在激發(fā)過程中同時被吸收，隨后發(fā)生與單光子過程相同的輻射衰減過程（圖2B）。在約650 nm處觀察到BTF點的明亮3PF，并在517 nm處觀察到來自三次諧波產(chǎn)生（THG）的尖銳信號峰（圖2B，C）。3PF和THG都是高階非線性光學(xué)效應(yīng)。3PF最大發(fā)射波長位于650nm 的FR/NIR區(qū)域，它具有較高的穿透深度和較低的光吸收，所以BTF點的強(qiáng)3PF更適合于活體生物成像。在1550nm處，BTF的三光子吸收截面σ3為2.56×10-79cm6?s2，遠(yuǎn)高于常用有機(jī)染料Rh6G（6×10-81?cm6s2）和一些先前報道的染料。BTF點的較高σ3值有利于深層組織生物成像。
他們首先研究了使用3PF成像系統(tǒng)通過小顱窗對小鼠腦血管進(jìn)行實時成像。如圖3A-C所示，3PF和THG信號匹配良好，這表明它們來自同一個納米探針。3PF和THG成像模式的結(jié)合提高了深部組織成像的可靠性。圖3D-F顯示了從0到900μm的不同穿透深度的小鼠大腦的三維高分辨率血管重建圖像。通過組合不同穿透深度的圖像（圖3J），從不同的視角（圖3K，L）重建高分辨率三維圖像，提供了關(guān)于主要血管網(wǎng)絡(luò)和微小毛細(xì)血管細(xì)節(jié)的清晰空間圖像。
他們進(jìn)一步將熒光BTF點應(yīng)用于具有完整顱骨的小鼠腦血管可視化。圖4A-C顯示了小鼠腦血管的三維高分辨率重建圖像，該圖像提供了主要血管系統(tǒng)和微小毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)的清晰空間圖像。所示微毛細(xì)管的半高寬在200μm深度處計算為0.95μm，在300μm深度處計算為1.59μm，在400μm深度處計算為2.08μm（圖5D-F）。
腦血栓形成是一種常見的腦部疾病，可導(dǎo)致急性腦損傷甚至死亡。因此，他們進(jìn)一步利用BTF納米點來監(jiān)測完整顱骨小鼠的腦卒中過程。首次利用AIE點對顱骨完整的小鼠大腦進(jìn)行3PF成像，利用紅外減反射低倍物鏡獲得大視場血管結(jié)構(gòu)的一般信息（圖4G，H）。在正常腦狀態(tài)下，可有效監(jiān)測到來自血管的高達(dá)92.1的強(qiáng)3PF信號。腦血栓形成后，3PF強(qiáng)度顯著降低至1.1的低值，與背景信號難以區(qū)分?；诰哂酗@著非線性光學(xué)效應(yīng)的超亮AIE點，他們首次以高對比度無創(chuàng)性地觀察了顱骨完整的活體小鼠腦血栓形成過程（圖4L）。
亮點小結(jié)
綜上所述，作者合成了明亮的AIE發(fā)光劑BTF，粉末狀態(tài)具有高達(dá)42.6%的量子效率。所得的AIE點具有高亮度、大Stokes位移、良好的生物相容性、良好的光穩(wěn)定性和大的三光子吸收截面。它們可以作為高效熒光探針，用于高穿透深度和圖像對比度的近紅外激光激發(fā)活體腦血管成像。首次報道用AIE點無創(chuàng)3PF顯微成像技術(shù)觀察小鼠腦卒中過程。這些良好的結(jié)果將有助于開發(fā)高效的固態(tài)近紅外發(fā)射器，用于無創(chuàng)監(jiān)測大腦疾病或功能紊亂。
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