目前，治療癌癥在很大程度上依賴靶向藥物，但是只有極少數(shù)的藥物通過臨床試驗。當前臨床前模型的低預(yù)測能力仍然是要克服的巨大挑戰(zhàn)。體外技術(shù)動物模型、微流體等已經(jīng)成為用于快速產(chǎn)生多個預(yù)測人體模型的重要工具。鑒于腫瘤微環(huán)境（TME）可以在癌癥進展、藥物吸收和/或耐藥中發(fā)揮作用，因此微環(huán)境中的腫瘤已成為研究重點。尤其是在藥物反應(yīng)的情況下了解腫瘤是如何影響微血管重塑和功能的。缺乏有關(guān)TME中腫瘤與內(nèi)皮相互作用的知識導(dǎo)致無法預(yù)測現(xiàn)有人類腫瘤模型。隨著用于生成體外微血管的工具（包括犧牲性模具和微流控技術(shù)）的開發(fā)，研究脈管系統(tǒng)在腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的作用也逐漸增加，包括在芯片上檢查腫瘤細胞的定位和遷移。盡管許多模型已被開發(fā)，但沒有一個模型能夠?qū)в醒芟到y(tǒng)的腫瘤整合到藥物中來。考慮到許多治療化合物靶向腫瘤增殖和生存能力，有必要研究其對TME的作用。
近日，麻省理工學院的Mark R. Gillrie教授團隊在《Advanced Functional Materials》上發(fā)表了Endothelial Regulation of Drug Transport in a 3D Vascularized Tumor Model，作者將3D腫瘤球體嵌入可灌注微血管網(wǎng)絡(luò)內(nèi)，文章旨在開發(fā)一種能夠在生理腫瘤微環(huán)境中預(yù)測藥物遞送的系統(tǒng)。這是首次在血管系統(tǒng)中培養(yǎng)腫瘤球狀體，目的是探索更具生化的腫瘤微環(huán)境中的藥物傳遞，并研究其對內(nèi)皮的影響和作用。兩種具有代表性的腫瘤(卵巢癌和肺癌)在局部顯著影響血管。腫瘤鄰近血管的形態(tài)和通透性的改變導(dǎo)致了藥物傳遞的差異，在復(fù)雜的TME和較簡單的球狀體之間很明顯，表明需要使用更相關(guān)的TME進行藥物測試。在臨床上采用藥物外排泵抑制劑的情況下，還對藥物的遞送進行了檢查，以改善化療藥物的吸收，證明其受內(nèi)皮調(diào)節(jié)。這種培養(yǎng)方法有助于研究各種靶向和生理學化合物，以及檢查免疫相互作用和原發(fā)性或獲得性耐藥性，這些都需要存在3D血管化微環(huán)境。
【研究成果】
1.血管化腫瘤模型的建立
為了增強癌癥藥物篩選的預(yù)測能力，作者開發(fā)了體外血管化腫瘤模型作為改進的病理生理平臺。該模型利用兩種3D體外技術(shù)作為簡化的腫瘤模型，并使用基于水凝膠的微流控技術(shù)生成相關(guān)的血管化腫瘤微環(huán)境（TME）。在設(shè)備中嵌入腫瘤球體（TSs），可在可灌注微血管的情況下探測腫瘤的生長/死亡（圖 1）。該系統(tǒng)可以直接檢查TS對內(nèi)皮的影響，并且可以通過血管將藥物轉(zhuǎn)運到腫瘤。作者使用卵巢癌（Skov3）和肺腺癌（A549）細胞來檢驗該平臺的實用性。兩種癌細胞都產(chǎn)生致密的聚集TS（圖1B）。然后在纖維蛋白凝膠中與人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）和正常人肺成纖維細胞（nhLF）共同培養(yǎng)。在前72小時內(nèi)，單個細胞在TS存在下延伸，互連并形成血管網(wǎng)絡(luò)，然后在第5天形成管腔。在共培養(yǎng)期間測量TS的生長，直徑增加（圖 1C，D）。
2．腫瘤特異性對血管形成的影響
除腫瘤表征外，這種培養(yǎng)方法還可用于研究周圍脈管系統(tǒng)腫瘤的變化。培養(yǎng)7天后，兩種類型的TS附近的脈管系統(tǒng)局部區(qū)域出現(xiàn)明顯差異（圖 2）。比起更遠端的radial骨區(qū)域，與TS最鄰近（近端）的區(qū)域的血管密度（血管/總面積）均降低（圖2A，B）。然而，與A549相比，Skov3腫瘤導(dǎo)致血管密度顯著降低。Skov3在靠近TS的血管網(wǎng)絡(luò)中誘導(dǎo)局部凋亡區(qū)域，這與A549附近均勻分布相反（圖2C）。作者認為血管密度和細胞凋亡的差異是由于兩種腫瘤類型之間遷移模式或細胞因子表達的改變所致。第7天后，盡管大量的Skov3從TS表面遷移，但它們距TS的距離遠小于A549（圖2D）。這種遷徙反應(yīng)可導(dǎo)致在TS附近血管死亡/密度差異，但也可能改變局部促炎性標志物濃度、代謝物和生長因子，或含有RNA或蛋白質(zhì)的外來體。因此，作者使用人類細胞因子抗體陣列來研究這些差異（圖2E）。結(jié)果表明A549 TS導(dǎo)致血管生成因子（包括血管生成素）的更高表達。
3.腫瘤引起的血管通透性變化
癌細胞可誘導(dǎo)血管通透性增加很大程度上是VEGF等信號分子引起的。作者以3D腫瘤附近和遠離空間的高分辨率研究這種現(xiàn)象。為此，將TS與新生的血管網(wǎng)絡(luò)共培養(yǎng)直至第4天，此時將單層接種到培養(yǎng)基通道中，最后在第7天使用熒光葡聚糖（40 kDa）將微血管灌注。通過熒光示蹤劑從血管內(nèi)到血管外空間的泄漏來計算微血管通透性 （圖3）。與A549相比，Skov3對與TS相鄰且距離更遠的血管滲透性有更顯著的影響，這可能是因為腫瘤相關(guān)信號的改變。此外，血管網(wǎng)絡(luò)（TS‐MVN）培養(yǎng)物中TNFα濃度僅略有增加，促炎細胞因子或其他局部分泌因子可能導(dǎo)致屏障功能受損，但需要進一步研究。腫瘤對相鄰血管重塑和通透性的局部影響將改變腫瘤藥物遞送。
4. 3D化學療法的血管運輸
為了測試該系統(tǒng)中藥物的遞送效率，用紫杉醇對微血管和球體進行了處理。MVNs的滲透性僅在紫杉醇濃度增加的情況下處理1小時就顯著增加（圖4B）。作者比較了簡單球體模型和系統(tǒng)之間的藥物輸送。紫杉醇被用于單獨治療和在血管網(wǎng)絡(luò)（TS‐MVN）內(nèi)的TS（圖4C–G）。在紫杉醇治療后72小時，腫瘤明顯的細胞死亡（圖4D）。對于單獨的球體（TS）治療，兩種腫瘤細胞系中紫杉醇濃度的增加都會導(dǎo)致胱天蛋白酶信號明顯升高（圖4E）。Caspase 3/7強度隨著紫杉醇治療而增加（圖4F）。雖然Skov3和A549 TS的半胱天冬酶強度沒有差異，但與TS相鄰的腫瘤外區(qū)域的細胞凋亡增加（圖4G）。作者還在紫杉醇治療后的24、48和72小時內(nèi)測量了腫瘤大小（直徑）（圖4H），治療后A549 TSs的總直徑持續(xù)增加，而Skov3 TS的直徑縮小。
5.相關(guān)TME中的耐藥性
通過Western blot和流式細胞術(shù)在所有細胞類型中檢測P-gp（也稱為MDR1）的表達。在紫杉醇處理后，A549和Skov3中的平均P-gp表達降低，但HUVEC中的平均P-gp表達顯著提高（圖5A）。與A549和Skov3相比，488-Taxol的吸收更高（圖5C）。腫瘤細胞中P-gp表達降低可能與其他藥物外排蛋白的表達增加相對應(yīng)，從而有助于耐藥性。最后，在3D模型中檢查了P-gp函數(shù)（圖5E）,該結(jié)果表明，與不存在MVN相比，紫杉醇和P-gp抑制劑的運輸都受到了MVN的阻礙。因此，P-gp抑制劑最終對所測試濃度的腫瘤中的化療藥物（488-Taxol）積累幾乎沒有影響，進一步證明了采用3D血管化腫瘤模型相關(guān)病理學的重要性。
6. TME和擴散限制的藥物遞送
在TS‐MVN系統(tǒng)中，成纖維細胞與腫瘤球體密切相關(guān)（圖 6A）。細胞占據(jù)了原本可以擴散的體積，并且還可能沉積大量的細胞外基質(zhì)（ECM）。實際上，諸如膠原蛋白III之類的基質(zhì)蛋白表達增加與耐藥性相關(guān)，并在腫瘤附近強烈表達（圖6B）。對于兩種癌細胞類型在不存在結(jié)合情況下分子擴散性，緊鄰TS且在TS自身內(nèi)的直接TME基質(zhì)中的擴散率顯著降低（圖6C）。雖然兩種細胞類型在基質(zhì)或TME基質(zhì)中的擴散率沒有差異，但腫瘤本身卻存在顯著差異。與Skov3相比，A549限制TS中的分子擴散（圖6D）。
【結(jié)論】
該工作的人類腫瘤芯片模型將可灌注微血管直接與腫瘤整合在一起，從而可以檢查關(guān)鍵的轉(zhuǎn)運機制。該模型證明了完整有效的血管網(wǎng)絡(luò)對于有效藥物輸送的重要性，因為腫瘤引起的重塑會顯著影響局部TME和脈管系統(tǒng)。該模型有可能進一步發(fā)展成更準確的臨床前模型，以檢查復(fù)雜的免疫細胞和靶向抗體之間的相互作用以及化學療法。
