王健君：中國科學院化學研究所 研究員
一百年前科學家“水變成冰要經(jīng)過冰核”這個中間態(tài)的預(yù)言一直不能得到證實，他的團隊攻克了這個百年的難題，并通過研究發(fā)現(xiàn)低溫動物的抗凍蛋白控制冰晶生長的控冰機制。這一基礎(chǔ)科學問題的突破，為食品、航空、醫(yī)療、生物等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了科學支持。當冰凍過程可控，作為超越人類極限的人體凍存技術(shù)或許可以期待。
大家可能知道冷凍保存，因為每家每戶都有冰箱，冰箱就有冷凍保存的功能。但是大家可能也會很好奇，為什么這幾年冷凍保存這么受關(guān)注,甚至有爭議？
比如說關(guān)于卵母細胞的凍存，提出了完全不同的議案，有些人支持卵母細胞的凍存，而另外一些代表則完全反對卵母細胞的凍存；
2016年英國法院判決一個患有絕癥的14歲女孩的母親勝訴，允許這位母親在其女兒死后將其凍存。這個判決當時引起了全世界的轟動，因為即使在今年科學界、法律界還有倫理等方面，對人體凍存都存在著爭議。
我們可以看一下冷凍保存的定義，就可以明白為什么凍存這么受關(guān)注，甚至有爭議。
冷凍保存就是將冷凍保存對象,如細胞、組織、器官等置于超低溫的環(huán)境當中，一般是指在零下196℃的液氮環(huán)境當中，使其新陳代謝大大降低，待恢復(fù)正常的生理溫度以后，這些凍存對象，細胞、組織、器官能恢復(fù)它正常的生理功能。如果將凍存對象換成人體，那就意味著幾十年以后，或者幾千年以后，這個人體如果能復(fù)蘇的話，就能實現(xiàn)永生了。
這是歷代的帝王、古代埃及的法老一直追求的夢想。所以大家可能能明白為什么凍存這幾年這么受關(guān)注，甚至有爭議。
世界上真正的第一例凍存的人體叫James bedford，他在其死后接受了冷凍保存，距今已經(jīng)有五十三年了。目前世界上總共有受凍存的人體約300例，其中包括兩個中國人。
現(xiàn)在我可以很肯定的告訴大家，所有這些凍存的人，由于技術(shù)的原因，他們是不可能復(fù)蘇的。
所以也有科學家認為將人體的冷凍保存是偽科學。但是美國的一個期刊《生活科學》，它是專門報道重大的科學突破和預(yù)測未來研究方向的一個雜志，它將人體凍存技術(shù)評為：十大超越人體極限的未來科學技術(shù)之一。
研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境的溫度降低的時候，能大大增加器官保存時間。比如說目前的器官的保存溫度是在零上4℃，它保存的時間是幾個小時，長的可以達到二十來個小時。
理論研究發(fā)現(xiàn)，如果將器官置于零下140℃的時候，可以長期的保持。事實上，目前有些細胞，將其置于零下196℃的液氮環(huán)境當中的時候，可以實現(xiàn)長期的凍存?？墒呛苓z憾的是，目前還沒有凍存器官的技術(shù)。所以導(dǎo)致保存器官的時間很短，幾個小時、長的二十來個小時，導(dǎo)致了大量的器官被廢棄。
研究數(shù)據(jù)顯示大約70%左右的，或者超過70%的心肺，由于短時間內(nèi)不能找到受體而被廢棄，這是非常遺憾的。因為即使在器官移植非常發(fā)達的美國，在七十個器官衰竭需要移植的人中，只有一個才能得到器官的移植。
所以在1970年，實施人類肝臟移植手術(shù)的，被稱為“器官移植之父”的Thomas Starzl就預(yù)言：“只有當保存器官的技術(shù)得到突破，使器官得以保存數(shù)周、甚至數(shù)月的時候，器官移植才有可能大范圍的推廣?！?/p>
但很遺憾，他這個說法已經(jīng)五十年過去了，現(xiàn)在的器官保存技術(shù)并沒有很大的進步。
除了保存器官，冷凍保存還有其他很大范圍的領(lǐng)域，比如說能挽救新冠危重患者生命的細胞療法，當然這個細胞療法也能治帕金森病，它的大范圍的推廣,必須依賴于干細胞的安全的冷凍保存；當然另外輔助生殖領(lǐng)域的生殖細胞的凍存，它的安全性和可靠性，也是非常關(guān)鍵的，因為這涉及到我們的下一代。
大家會問，為什么五十年來凍存技術(shù)沒有得到突破的進展，或者它的關(guān)鍵的科學問題是什么呢？
其實冷凍保存有三要素：第一，當然是凍存對象：細胞、組織、器官；大家知道器官里面有超過70%的是水分，將這些水分置于零下的時候，它必然會結(jié)冰，所以這就涉及到凍存的第二要素，這些冰如果不控制的話,它必然會傷害細胞器官。
這是一組光學顯微鏡圖片，可以看到卵母細胞在冰凍前后受到了冰晶的損害；凍存第三個要素就是要添加冷凍保護劑，使器官細胞內(nèi)避免大冰晶的產(chǎn)生，使器官受到保護，免受冰凍的傷害。
目前大量使用的凍存保護劑是一種與鹽相似的，一種跟水能發(fā)生強作用的分子。它的加入可以使器官內(nèi)部在低溫下面不結(jié)冰。但是要使器官內(nèi)將近70%的水分，在零下140℃下面不結(jié)冰，那必須添加大量的這種有毒的鹽。
有美國的科學家理論分析發(fā)現(xiàn)，當鹽的重量比達到50—60%的時候，器官內(nèi)可以實現(xiàn)不結(jié)冰，但是我剛才說了，這么高濃度的鹽,必然對細胞有損害。
比如說目前普遍使用的凍存劑的一種，也是另外一種鹽的分子，當它的濃度超過2%的時候，它會損害細胞，當然嚴重的時候，會改變它的一些基因。
由于這個原因，所以世界上很多的科學家都努力嘗試著降低有毒的鹽分子的使用。
一個方法就是可以快速地降低溫度，然后升高溫度。在水還沒反應(yīng)過來變成冰之前，已經(jīng)達到了預(yù)期溫度。但這個方法對細胞是適用的，因為細胞體積小、結(jié)構(gòu)簡單，但是對器官是不適用的，因為器官體積大、復(fù)雜。
這樣快速降溫、升溫的時候，必然導(dǎo)致有個溫度梯度的存在，就意味著在器官里面，有些地方溫度高，有些地方溫度低，當然都是零下的。相對比較溫度高的地方，必然會形成大冰晶損害器官。這也是目前能凍存細胞，但是不能凍存器官的一個原因。
大家肯定會問，能不能有其他的凍存的方法避免這種有毒的鹽的使用？
其實自然界確實有一些生物，它可以在酷寒下生存。比如說生活于沙漠地區(qū)的甲蟲，叫小胸鱉甲；生活于極地的這種雪虱；還有生活于我國東北地區(qū)的冬尺蠖；還有阿拉斯加林蛙等等。
我2013年12月去新疆采集這種蟲子，叫小胸鱉甲。當時氣溫是零下30℃左右，當我們把雪移開，這個蟲子就跟土壤搭在一塊，就像凍成一塊的。但是很有意思的事情，我把蟲子放在我手上幾分鐘以后，蟲子能爬起來。這確實是非常神奇。
大家可能也會問，這些蟲子體內(nèi)不可能含有大量的有毒的鹽。如果有的話，它沒被凍死可能也被毒死了,對吧？
所以對自然界控冰體系的、生物體系的研究，必然會為我們冷凍保存提供新的思路。
確實也有很多科學家研究為什么這些蟲子能在低溫下生存？他們發(fā)現(xiàn)蟲子體內(nèi)主要存在的兩類蛋白能控制冰晶的形成：一類叫抗凍蛋白，它能控制冰晶的生長；另一類叫冰晶核蛋白，它能控制冰晶的成核。
我得說一下冰晶的形成可以分成兩步：一步是成核，一步是生長。
成核最初是一百多年前美國的科學家吉布斯提出來的。他通過簡單的宏觀的能量分析，提出冰晶的形成必然會經(jīng)過一個形成臨界冰核的階段。如果臨界冰核沒有形成的話，冰晶不可能生成。
經(jīng)典成核理論提出已經(jīng)一百多年了,但提出的時候, 這么多年一直有爭議，有些人支持這個經(jīng)典成核理論，有些人則反對經(jīng)典成核理論。
關(guān)鍵就是目前實驗上沒有探測到臨界冰核的存在。
有三個難點：一個就是臨界冰核尺寸小。尺寸小到什么地步呢？是納米級別,相當于我們頭發(fā)絲的幾萬分之一；另外一個臨界冰核存在的時間窗口很短，瞬間的，是納秒級別，非?？?；另外一個它是隨機發(fā)生的，隨機意味著什么？它不可預(yù)測，沒有規(guī)律。
由于以上三個難點，世界上最先進的儀器，沒法捕捉到臨界冰核，導(dǎo)致了經(jīng)典成核理論是否適用于冰晶的形成，一直存在著爭議。
我們根據(jù)自然界當中存在著兩類蛋白，一類就是冰晶核蛋白，是目前世界上最好的冰晶成核劑；另一類是抗凍蛋白，它沒有明顯的促進冰核形成的效果。更有意思的事情，這兩類蛋白唯一的區(qū)別就是尺寸不一樣。抗凍蛋白納米級別，冰晶核蛋白是幾十納米，兩者差一個數(shù)量級。
為什么尺寸對冰核的形成如此重要？換句話說，是不是可以制備一系列的不同尺寸的這類蛋白，讓它去探索這個臨界冰核，是不是可以把臨界冰核捕捉??？
事實上，我們通過生物工程的方法制備了一系列的蛋白，但是遺憾的是，這類蛋白大到十幾納米的時候，機械性能不好，它會產(chǎn)生彎曲，所以這種蛋白材料，不可能用來單變量的研究尺寸的影響，所以我們繼續(xù)找，找到另一種材料叫氧化石墨烯。
氧化石墨烯就是很薄的一層片層，并且它的機械性能非常好。我們可以制備一系列尺寸氧化石墨烯。這是氧化石墨烯的電子顯微鏡圖片，可以從3納米、8納米、11納米、21納米、50納米等等。我們就可以用這些納米顆粒去模擬蛋白，去研究尺寸對冰晶成核的影響。
確實實驗發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯納米顆粒的尺寸，與冰晶成核過冷度的乘積是一個固定值，并且這個固定值具有普適性。它對氧化石墨烯的狀態(tài)，無論是分散在水里面的，還是固定在表面的不同顆粒都適用。
這么一個普適的物理現(xiàn)象，必然后面有一個理論機制。
當然我們通過理論分析發(fā)現(xiàn)，其實氧化石墨烯上臨界冰核的形成過程，與我們往杯子里面倒水的這個過程相類似。當我們往杯子里面倒水的時候，水平面與杯沿齊平的時候，水不會溢出來。我們繼續(xù)倒水，水會鼓出來，這時候表面張力會把水包住。繼續(xù)倒水，鼓到一定臨界程度的時候，水會忽然溢出來。
臨界冰核也是這種情況，它會在氧化石墨烯上形成，迅速漲到納米顆粒的邊緣。這時候由于在表面張力作用下，它不會形成冰晶，只有它繼續(xù)鼓，鼓到一定程度，它會忽然瞬間的形成冰晶。進一步理論分析發(fā)現(xiàn)，當氧化石墨烯的顆粒，與臨界冰核的尺寸相當?shù)臅r候，冰晶才有可能形成。
那就意味著，我們可以用納米顆粒，做一把尺子去量臨界冰核，從而我們就證實了一百多年前吉布斯等人預(yù)測的臨界冰核的存在。
接下來我們繼續(xù)講講這個能控制冰晶生長的抗凍蛋白的控冰機制。
這是2013年我去新疆采集樣品的現(xiàn)場照片，可以看到蟲子就在雪和土壤之間。這個蟲子能在酷寒下生存的重要原因之一，就是體內(nèi)存在抗凍蛋白。
抗凍蛋白有兩個面,就像我們手機一樣，當然尺寸是納米級別的。
最初是一個美國科學家發(fā)現(xiàn)了這種抗凍蛋白，所以很多科學家研究了抗凍蛋白的抗凍冰機制。但是五十多年來，關(guān)于抗凍蛋白它是喜歡冰或者不喜歡冰，一直存在爭議。
我是2010年開始做這個研究的。我發(fā)現(xiàn)所有這些研究，它沒有明確到底哪一個面喜歡冰，或者哪一個面不喜歡冰？我就想，我能不能把納米尺度的抗凍蛋白定向固定住，然后選擇性研究抗凍蛋白每一個面的親冰或者親水性能。
這個想法當然算不錯了，示意圖畫的很簡單，但實驗操作上是非常困難的。
我的兩個博士生去做這個事情，最后有個叫劉凱的碩博生，克服了兩個困難，一個要把是納米級別的，用手機定向固定是非常難的；另外一個，我定向固定還不夠，還要維持蛋白的活性，花了可能六年的時間，他做到了。發(fā)現(xiàn)蛋白有兩個面，每個面的親冰、親水不一樣，一面親冰，一面親水。
為什么之前有這個爭議？相當于我們有個“盲人摸象”的故事一樣。
我們通過定向固定，選擇性研究抗凍蛋白的性能，解決了這個爭議。
解決這個爭議以后，對我們理解抗凍蛋白的控冰機制有什么幫助呢？
大家看一下這個示意圖：蛋白它一面親冰，可以跟冰很好的結(jié)合；一面親水，可以跟水很好的結(jié)合。這樣就在冰水界面形成很薄的一層蛋白層面，或者分子層面的一堵墻，阻礙了水變成冰，這就是一個抗凍蛋白的控冰機制。
通過我們對自然界控冰體系的研究，我們可以看出，自然界它不是用簡單地加大量的鹽去保護自己，而是通過控制冰的成核，控制冰的生長。
我們算有所發(fā)現(xiàn)，在有所發(fā)現(xiàn)以后，我們也做到了有所創(chuàng)造，這是我們做材料的一個特色。
我們制備了一些能控制冰晶形成的冷凍保護材料。比如我們目前輔助生殖技術(shù)里面，要用大量的凍存液凍存生殖細胞，精子、卵子、還有受精卵等等。目前這些凍存液都來源于外國進口，更嚴重的是，這些凍存液用的是傳統(tǒng)的方法，含有一些二甲基亞砜，剛才我說了它有毒的。用我們的這個分子凍存卵母細胞以后，它復(fù)蘇率優(yōu)于目前市場上二甲基亞砜含量15%的，細胞的復(fù)蘇率遠優(yōu)于進口的二甲基亞砜含量為零的復(fù)蘇率。
目前我們在東莞松山湖材料實驗室的支持下，嚴格按照國家的標準，正在生產(chǎn)這些凍存試劑。當然我們也研制了一系列能用于干細胞凍存的凍存液。
比如我們用于臍帶間充質(zhì)干細胞凍存的材料。用我們這個材料凍存干細胞以后，它的復(fù)蘇率達到了92%，優(yōu)于或者遠優(yōu)于市場上有毒的二甲基亞砜含量為10%的凍存液。
目前我們與北醫(yī)三院的眼科合作，我們希望通過我們創(chuàng)制的一些新的控冰材料，通過從凍存簡單的組織器官入手，比如說眼角膜的凍存。
希望通過我們材料的創(chuàng)新，使凍存技術(shù)得到進步，當然是突破性的進步，讓許多醫(yī)療技術(shù)能充分發(fā)揮它們挽救生命的能力。
這是我的一個德國合作者，他2018年去南極捕魚，提取魚內(nèi)的抗凍蛋白。
大家知道前段時間有報道，我們一般的老百姓可以到空間站去待幾天，當然這是距離比較短的。
我們知道宇宙很廣袤，如果想要旅行的話，可能會花幾十年算少的。我們從地球到那個地方，如果沒有采取措施的話，可能生命已經(jīng)結(jié)束了。
我們希望與世界上不同領(lǐng)域的科學家合作，使冷凍保存助力我們以后的星際旅行。
